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從實(shí)驗(yàn)室到生產(chǎn)線:固態(tài)光源技術(shù)在生物成像與工業(yè)檢測中的性能提升

更新時(shí)間:2024-09-11 點(diǎn)擊次數(shù):1824

從實(shí)驗(yàn)室到生產(chǎn)線:固態(tài)光源技術(shù)在生物成像與工業(yè)檢測中的性能提升


生物醫(yī)學(xué)成像和工業(yè)計(jì)量的照明系統(tǒng)規(guī)格通常集中在光譜、空間和時(shí)間的光輸出特性上。Lumencor的技術(shù)支持總監(jiān)Iain Johnson和我們分享了固態(tài)光源陣列——LED、發(fā)光管和激光器組合成的固態(tài)光引擎如何實(shí)現(xiàn)規(guī)格定制,以滿足特定應(yīng)用的照明要求。


固態(tài)光引擎是一個(gè)集中控制的固態(tài)光源陣列,其輸出合并到一個(gè)共同的光學(xué)傳輸系統(tǒng)中(圖1)。光源的輸出可以并行激活以產(chǎn)生白光(圖2),或在需要分離的波長時(shí),也可按順序進(jìn)行激活(圖3、圖4)。光源本身可以采用一種固態(tài)照明技術(shù),即LED、光導(dǎo)管或半導(dǎo)體激光器,也可以對這些光源技術(shù)進(jìn)行組合。這可以根據(jù)zui終用戶的應(yīng)用對亮度、角度分布和輻照度的要求進(jìn)行定制。根據(jù)這一定義,光引擎輸出的光譜分布可以通過加法組合,而這與傳統(tǒng)的寬光譜照明設(shè)備(電弧放電和白熾燈)形成鮮明對比。傳統(tǒng)的照明設(shè)備產(chǎn)生的光譜分布在物理上是不變的,只能通過選擇性的阻擋和衰減來調(diào)整。從工程學(xué)的角度來看,固態(tài)光源的第二個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是,它的輸出可以在強(qiáng)度(圖2、圖4)和時(shí)間(圖4、圖5)方面進(jìn)行精確控制。因此,光譜輸出單元件的差異很小(圖2),這使得光引擎應(yīng)用于不同成像系統(tǒng)時(shí),所獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量能保持一致。


圖1.固態(tài)光引擎及其輸出光譜的概念圖。四個(gè)固態(tài)光源的輸出被合并入一個(gè)共同的光路,并通過光導(dǎo)耦合進(jìn)入纖維及或者圖像掃描儀。在實(shí)際操作中,光源可以是2-21個(gè),具體數(shù)量取決于應(yīng)用要求。光源可以是LED、光導(dǎo)管或半導(dǎo)體激光器其中的一種或組合。它們的輸出可以經(jīng)過濾波(F)以細(xì)化光譜。輸出光的一部分會(huì)被分離出來,并導(dǎo)向參考光電二極管(rPD),以提供控制反饋。


在大多數(shù)生物醫(yī)學(xué)成像應(yīng)用中,不需要持續(xù)照明,甚至在某些情況下,會(huì)起到反效果,影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。通常情況下,照明與相機(jī)曝光會(huì)同步進(jìn)行。這里有兩個(gè)重點(diǎn):首先是光源間的切換速度,其次是脈沖間隔的復(fù)現(xiàn)性。相比和機(jī)械濾光輪耦合的白光照明器(約50ms的切換時(shí)間),光引擎可以做到小于1ms的光源間切換(圖4),縮短了獲取多色圖像Z軸堆疊或者玻片掃描所需的時(shí)間。脈沖間的積分不變形(圖5)是決定延時(shí)圖像序列保真度的關(guān)鍵因素。每個(gè)脈沖的積分量化了在延時(shí)序列中每次曝光所需的照度。脈沖之間的照度差異越小,樣品動(dòng)態(tài)行為的敏感度就越能增加,這在圖像幀到幀的變化間可以體現(xiàn)。


圖2.28臺(tái)SOLA V-nIR光引擎(Lumencor, Inc., Beaverton OR)的光譜輸出曲線疊加。光引擎的總光輸出由光譜曲線所包圍的區(qū)域來量化。所有28臺(tái)光引擎的平均輸出功率為4558mW,標(biāo)準(zhǔn)差(n=28)為91mW,相當(dāng)于2%的方差系數(shù)(CV)。


圖3.SPECTRA光引擎(Lumencor, Inc., Beaverton OR)的光譜輸出,包括LED、發(fā)光管或激光器。發(fā)光二極管和光導(dǎo)管的波長規(guī)格(nm)代表了中心波長(CWL)/半高全寬(FWHM),已經(jīng)通過內(nèi)置的濾光片來改進(jìn)光源輸出。功率(mW)是在光導(dǎo)(連接到顯微鏡或光學(xué)掃描儀)的遠(yuǎn)端測量得到的。


集成三種不同類型的固態(tài)光源,可以在整個(gè)可見光和近紅外波段內(nèi)提供均勻的功率輸出。


圖4.由TTL觸發(fā),AURA光引擎(Lumencor, Inc., Beaverton OR)交替輸出485nm(約0.5ms寬)和560nm(約3ms寬)的脈沖(示波器記錄)。圖中顯示了兩條疊加的示波器軌跡,其中485nm的強(qiáng)度通過RS232串行命令從100%調(diào)整到55%,而560nm的強(qiáng)度保持不變。485nm和560nm的脈沖時(shí)間間隔為0.25ms。


圖5.模擬光電二極管(APD)檢測來自一臺(tái)5光源的AURA光引擎(Lumencor, Inc., Beaverton OR)發(fā)出的5ms光脈沖。圖中展示了10個(gè)脈沖序列,代表了每次數(shù)據(jù)采集中記錄的150個(gè)連續(xù)脈沖。計(jì)算了150個(gè)脈沖序列中每個(gè)脈沖的積分光輸出。對于555/28 nm輸出,150個(gè)脈沖的方差系數(shù)(CV)在555/28 nm脈沖串中為0.23%,在635/22 nm脈沖序列中為0.20%。其他三個(gè)源通道的CV值相似(0.15-0.25%)。


除了光譜帶寬(圖3)以外,固態(tài)LED、光導(dǎo)管和激光器之間的主要區(qū)別在于其光輸出的角度分布;LED和激光器之前的zui大區(qū)別如表1所示。對于寬場顯微鏡應(yīng)用,LED光源配置為科勒照明產(chǎn)生的均勻照明,輻照度范圍為1-100mW/mm2。然而,單分子定位顯微鏡(SMLM)需要更高的輻照度,通過鏈接到顯微鏡臨界落射照明器(critical epilluminator)的CELESTA光引擎(Lumencor, Inc., Beaverton OR),可以在樣品表明提供10^4mW/mm2的輻照度(圖6)。臨界照明的使用是由科勒照明在光學(xué)上的低效率所決定的,因?yàn)榭评照彰鞑]有覆蓋整個(gè)光源表面或者發(fā)射光的全部角度分布。在臨界照明中,光源被直接成像到樣品平面上,這種方法更為高效,但對光源輸出中的任何空間不均勻性也更為敏感。臨界落射照明器的作用是均勻化任何空間上的不均勻性,以產(chǎn)生與典型scmos相機(jī)傳感器尺寸(~200mm2)相匹配的高輻照度照明場。


Light Source

Power(mW)

light guide

Light Guide Cross Section

Area(mm2)

NA

Etendue (mm2 sr)

LED

500

Liquid light guide

Circle,

3mm dia

7.07

0.30

2.00

Laser

800

multimode fiber

Square, 0.4*0.4mm

0.16

0.22

0.02

表1. 光源比較


①輸出功率是在zhi定光導(dǎo)的遠(yuǎn)端測量的

②使用光導(dǎo)將光源輸出耦合到顯微鏡或光學(xué)掃描儀

③光導(dǎo)的數(shù)值孔徑

④光通量積決定了光學(xué)檢測系統(tǒng)有效利用光源輸出的能力。當(dāng)光源的光通量積與光學(xué)系統(tǒng)的光通量積緊密匹配時(shí),可以獲得很好的性能。sr=球面弧度。

 

針對光驅(qū)動(dòng)生物技術(shù)以及工業(yè)應(yīng)用,優(yōu)化光源的選擇性需要全面考慮儀器的光譜、空間和時(shí)間要求,這些正是需要照明光源來支持的。通常一種技術(shù)盡可以滿足其中的部分要求,所以策略即是混合多種技術(shù)來滿足全部需求。復(fù)雜的光引擎可以提供這樣一種集成的方法來混合光源,并克服任何給定技術(shù)的基本限制,例如,在熒光分析中,LED在500-600nm的光中由于臭名昭著的“綠色間隙"功率和亮度往往無法滿足;或者相對于毫秒級的切換時(shí)間,任何弧光燈的開/關(guān)不穩(wěn)定性;又或者廣譜光源進(jìn)行多路復(fù)用研究時(shí),譜寬也帶來了限制。如今各種固態(tài)光源各有優(yōu)劣,只有仔細(xì)評估它們的優(yōu)點(diǎn)與局限性,才能為光驅(qū)動(dòng)生命和材料科學(xué)應(yīng)用的廣泛領(lǐng)域找到zui合適的照面解決方案。


圖6.使用CELESTA光引擎(Lumencor, Inc., Beaverton OR),通過一根直徑800um的光纖耦合到安裝在尼康Ti/Ti2顯微鏡的臨界落射照明器上,并產(chǎn)生均勻的熒光玻璃成像。使用尼康60/1.4 NA Plan Apo物鏡和Andor的 Zyla 5.5 (2560 x 2160 pixels) scmos相機(jī)進(jìn)行圖像捕捉。圖表顯示了相機(jī)沿著標(biāo)記為紅色的對角線所記錄的灰度值。右上角的插圖展示了使用尼康10X/0.3 NA Plan Apo物鏡成像的同一樣品。




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